Vergleichende thermodynamische Analyse der Substratbindung an die rekombinante Oktopindehydrogenase aus der Pilgermusche

Opindehydrogenasen terminieren im Energiestoffwechsel verschiedener mariner Invertebraten die anaerobe Glykolyse, indem sie die reduktive Kondensation einer Aminosõure mit Pyruvat oder einer anderen a-Ketosõure zu einem Opin und Wasser katalysieren, wobei NADH zu NAD+ reoxidiert wird. Bei Vertebraten sowie bei Crustaceen, Spinnen und Insekten ³bernimmt die Laktatdehydrogenase diese Aufgabe. Wie bei diesen Tieren die LDH, stellt bei vielen Mollusken die Oktopindehydrogenase einen adaptiven Mechanismus in Flucht- und Kampfreaktionen dar. Zur Aufklõrung der Struktur und des molekularen Reaktionsmechanismus der alternativen Pyruvatoxidoreduktasen erwies sich die Oktopindehydrogenase als besonders geeignet, da nach Aufklõrung der Primõrstruktur und heterologer Expression in E. coli das Enzym in ausreichender Menge und homogen zur Verf³gung stand (Jan¯en, 2000). Obwohl biochemisch bereits gut charakterisiert, gibt es ³ber den Reaktionsmechanismus der ODH jedoch widerspr³chliche Informationen. Durch einen Vergleich der thermodynamischen Parameter f³r die Substratbindung an ODH und LDH sollten einerseits der kinetische Mechanismus der ODH-Reaktion identifiziert und andererseits die Frage nach einem Selektionsvorteil durch den Besitz alternativer Pyruvatoxidoreduktasen f³r die verschiedenen marinen Invertebraten zumindest ansatzweise geklõrt werden. Die thermodynamische Analyse der Substratbindung an die rekombinante Oktopindehydrogenase hat gezeigt, dass diese nach einem geordnet-sequenziellen Mechanismus erfolgt. An das freie Enzym bindet zuerst die reduzierte Form des Coenzyms, NADH, wodurch eine Konformationsõnderung hervorgerufen wird, welche die Bindung des ersten Substrats, L-Arginin, erm÷glicht. Durch die Bindung des L-Arginins wird wiederum eine Konformationsõnderung induziert, welche die Bindung des zweiten Substrats, Pyruvat, gestattet. Dadurch werden die Substrate in die rõumliche Nõhe des Nikotinamidrings gebracht. Erst dann ist der Hydridtransfer auf den _bergangszustand m÷glich, dem aus Pyruvat und L-Arginin gebildeten Imin. Sowohl die Substrate L-Arginin und Pyruvat als auch D-Oktopin k÷nnen mit dem jeweils komplementõren binõren Komplex sogenannte édead-endÆ-Komplexe bilden, die wom÷glich eine Rolle bei der Regulation der Enzymaktivitõt spielen. Sowohl bei der LDH (Clark et al., 1989) als auch bei der ODH ist eine His-Asp-Arg-Triade an der Pyruvat-Bindung und an der Katalyse ma¯geblich beteiligt (Jan¯en, 2000; M³ller, pers÷nliche Mitteilung). Trotzdem unterscheiden sich beide Dehydrogenasen in ihrer Affinitõt zum Substrat Pyruvat. Wõhrend Pyruvat mit einer hohen Affinitõt an einen binõren LDHòNADH-Komplex bindet, war eine Bindung an einen ODHòNADH-Komplex nicht detektierbar. Es ist wahrscheinlich die L-Arginin-induzierte Konformationsõnderung, welche die katalytische Triade in die f³r die Pyruvat-Bindung essentielle hydrophobe Umgebung bringt. Der kinetische Mechanismus der ODH-Reaktion ist also darauf ausgelegt, die Entstehung von L-Laktat in einem putativen ODHòNADHòPyruvat-Komplex zu verhindern. Neben der Regenerierung von Reduktionsõquivalenten wird durch die ODH-Reaktion auch die Konzentration freien L-Arginins verringert. In den Geweben mariner Lebewesen kommen freie Aminosõuren oft in hohen Konzentrationen vor, da sie diese f³r die Osmoregulation ben÷tigen. Hohe Argininkonzentrationen haben sich dabei als ung³nstig f³r den Organismus erwiesen. Aufgrund seiner positiven Nettoladung geht L-Arginin vielfach Wechselwirkungen mit den verschiedensten Metaboliten ein und hemmt Enzymaktivitõten. D-Oktopin hingegen zeigt diesen Effekt nicht (Bowlus und Somero, 1979). Durch die Bildung von D Oktopin k÷nnten demnach, neben der Regenerierung von Reduktionsõquivalenten wõhrend starker Muskelaktivitõt, auch st÷rende, hohe L-Argininkonzentrationen im Organismus vermieden werden. Offenbar scheint dieses f³r marine Invertebraten der einzige Vorteil der Oktopindehydrogenase gegen³ber der Laktatdehydrogenase zu sein.