La somministrazione di metanfetamina produce un incremento di proteina prionica in vitro e in vivo

La proteina prionica (PrPc) è una glicoproteina altamente conservata, espressa sulla superficie cellulare di tutti i tessuti di mammifero, in particolare nel sistema nervoso centrale (SNC). Nel SNC è espressa fisiologicamente in diverse aree cerebrali e data la sua localizzazione sulla membrana plasmatica sono state ipotizzate diverse possibili funzioni: facilitazione degli impulsi nervosi mediando la trasmissione del segnale dalla matrice extracellulare all’ambiente intracellulare, regolazione del ritmo circadiano, azione anti-apoptotica e possibile implicazione nell’omeostasi del rame. Teorie più recenti ipotizzano che tale proteina sia anche coinvolta nella risposta cellulare specifica verso particolari infezioni batteriche. L’alterazione della struttura secondaria della proteina prionica porta alla forma alterata nota come “scrapie-like prion protein” (PrPsc), le due forme di proteina differiscono solo per un cambio conformazionale e condividono la stessa struttura primaria e le stesse modifiche post-traduzionali. Questo cambio strutturale altera significativamente le proprietà chimico-fisiche e biologiche della PrPc. La PrPsc essendo poco solubile precipita formando aggregati che innescano una reazione a catena autopropagandosi in un organismo ospite e danneggiando il tessuto nervoso. Il meccanismo di conversione della PrPc nella sua forma mutata è ancora sconosciuto. Lo scopo della presente tesi è stato di indagare per mezzo di esperimenti in vitro e in vivo se il trattamento con metanfetamina (METH), una neurotossina usata come sostanza d’abuso e capace di indurre stress ossidativi in diverse aree cerebrali, può indurre l’accumulo di PrPc e promuovere la formazione di PrPsc. Gli studi in vitro sono stati condotti sia su colture cellulari di PC12 e sia su colture striatali primarie. Le cellule PC12 sono state esposte a 1mM di METH per un tempo di 12, 24, 72, 168 ore e successivamente processate per indagini di Western blot, immunocitochimica e immunoelettromicroscopia. Le colture primarie di cellule striatali sono state esposte a differenti dosi di dopamina (DA), 0, 1-1, 0 mM, per un tempo da 24 a 168 ore e successivamente processate per analisi di microscopia elettronica a trasmissione. Per gli studi in vivo sono stati utilizzati topi maschi C57Black di 8-9 settimane trattati con una dose neurotossica di METH (5mg/kg x3 ogni 2 ore) e sacrificati a tempi diversi (24-168 ore dopo il trattamento). Gli animali anestetizzati con cloralio idrato, sono stati toracotomizzati e perfusi con fissativo. Gli encefali sono stati fissati e inclusi per la microscopia ottica. Per le indagini di Western blot dai cervelli sono stati dissezionati gli striati e la corteccia sensori-motoria. Gli studi in vitro, condotti su PC12 dopo esposizione a METH, hanno evidenziato un aumento significativo di PrPc e di PrPsc già a 12 ore di trattamento. Tale aumento è stato osservato sia nel nucleo che nel citoplasma. Poiché studi recenti hanno dimostrato che una esposizione prolungata delle PC12 a METH (72 ore) produce la formazione di inclusioni citoplasmatiche che contengono proteine sia del sistema UP che del sistema autofagico, è stato quindi interessante verificare l’eventuale presenza delle due forme di PrP in tali inclusioni. L’osservazione al microscopio elettronico ha evidenziato che negli inclusi citoplasmatici sono presenti le due forme della proteina prionica. Gli studi in vitro su cellule GABAergiche striatali dopo esposizione a DA hanno mostrato risultati analoghi a quelli osservati per le PC12. Anche in questo caso si è osservato un aumento significativo delle due forme di proteina prionica rispetto al controllo. Negli esperimenti in vivo è stato osservato un incremento di espressione di PrPc e di PrPsc nello striato e nella corteccia sensori-motoria di animali trattati con METH a 168 ore dal trattamento. In conclusione gli esperimenti in vitro e in vivo hanno prodotto analoghi risultati dimostrando che la somministrazione di METH produce un aumento sia dei livelli di PrPc sia di PrPsc. Gli effetti neurotossici della METH in cellule catecolaminergiche sono mediati dalla DA che determina uno stress ossidativo responsabile indirettamente della saturazione dei sistemi di detossificazione cellulare (sistema ubiquitina-proteasoma e sistema autofagico). Questo ha come conseguenza un’inibizione dei sistemi stessi e quindi, tale inibizione, è probabilmente responsabile dell’ accumulo di PrPc da cui deriva la forma alterata PrPsc con conseguente neurotossicità. I nostri dati nel loro insieme dimostrano che in assenza di mutazioni del gene per la proteina prionica o da infezioni da prioni, trattamenti con METH possono causare un accumulo di PrPc e PrPsc.